Reveal®大肠杆菌O157：H7菌检测系统
AOAC官方方法
No.2000.13(8小时富集) No.2000.14(20小时富集)
主要用途
Reveal大肠杆菌O157：H7检测系统可用于快速鉴定各种食品中大肠杆菌O157：H7，完成对大肠杆菌O157：H7的检测和初步鉴别只需要8小时。
测试原理
本系统利用不同富集培养基，它能够为大肠杆菌O157：H7提供易利用的营养成分，以及其它大肠杆菌O157：H7生存及快速生长的必要因子。使用Reveal培养基，可以在8小时内获得结果。使用**学分析指南（BAM，1998）或USDA/FSIS提供的富集培养基，结合Reveal检测装置,可以在20小时内完成检测.
将少量富集培养物（120μl）滴加到Reveal 检测卡的圆形样品区内，样品通过毛细管作用渗过含特异性大肠杆菌O157：H7抗体（与胶体金颗粒相偶联）的试剂区。如果样品中存在抗原（即大肠杆菌O157：H7），它将与胶体金标记的抗体结合。该抗原-抗体复合物渗过试剂区，经过含有大肠杆菌O157：H7抗体（分布呈带状）的硝化纤维膜。该含金**复合物被捕获并聚集在这个区域，从而显示一条可见的线。剩余的样品继续迁移而进入位于膜末端的废液贮存处。
试剂区也含有针对广谱抗原的金复合物（指示剂），无论大肠杆菌O157：H7存在与否，它都会被样品溶液释放。胶体金复合物对照指示剂通过膜迁移到阴性对照捕获区（含针对广谱抗原的抗体区），捕获并集结成一条可见线。无论大肠杆菌O157：H7抗原存在与否，都会在对照区形成对照线，以保证检测过程操作正确无误。
主要使用者
该测试系统旨为熟悉大肠杆菌O157：H7分离与鉴定中无菌操作技术的人员而设计的。建议不具备微生物基础知识的使用者参加Neogen公司的技能培训。
规格-对比性能研究
以下数据显示该检测系统对大肠杆菌O157：H7具有很高的特异性及灵敏度,研究也表明, Reveal大肠杆菌O157：H7对USDA/FSIS Rev.4,LC38高水平筛选具有明显优势,其中一项研究被AOAC/FSIS引用(Sharar & Rose,1994),结果表明该方案的性能标准接近或超过其它任何筛选方法.规格如下:
Reveal装置 USDA标准
灵敏度 99.9% >97.0%
特异性 99.4% >90.0%
假阴性率 <1.0% <2.0%
假阳性率 <1.0% <9.6%
效率 99.7% >94.0%
快速富集生长会产生104到105大肠杆菌O157：H7 CFU/ml阳性反应
提供的材料
Reveal检测试剂盒
20个单独包装的大肠杆菌O157：H7检测装置
20个移液管
Reveal 8小时培养基或20小时培养基
选择材料
参考该说明书后面的其它培养基,可以和Reveal大肠杆菌O157：H7检测系统配合使用
试剂盒不提供的必需品
无菌袋
**分离器或替代品
25g微量天平
计时器
8小时检测系统
13×100mm聚丙烯或玻璃试管
42℃±1℃温箱
5ml无菌吸管
水浴或其它热源(如:本生灯,微波炉)
20小时检测系统
36℃±1℃温箱
新生霉素钠
储藏
不用时，检测装置应储存于2-8℃；干粉培养基本储存在室温下（15-30℃）。
不同物品的检测
本装置可有效地用于许多物品中大肠杆菌O157：H7的检测,请与Neogen公司代表联系,获得一份确认检测物品的修正表格,或者对特殊物品的研究材料
培养注意事项
除了下述富集方法制备的样品外，Reveal大肠杆菌O157：H7还适用于其它培养方法制备的样品中大肠杆菌O157：H7的检测。请与Neogen联系以获得更多有关的信息。
警惕
1 不要使用过期的培养基
2 打开小袋前，让检测装置温度升至室温
3 使用水化培养基须在6小时内准备
4 培养时间和温度尤为重要，否则会导致错误结果
5 在培养过程中样品袋不能扎得过紧，以便于空气交换；这对大肠杆菌 O157：H7生长及抗原表达至关重要
6 使用8小时培养基时无菌水应该到42℃±1℃
7 使用8小时检测系统时,富集的培养物的检测应在培养后的4小时内完成
使用20小时检测系统时,富集的培养物的检测应在培养后的8小时内完成
8 适当采用良好微生物实验室操作规程
一、样品准备和培养
A 8小时检测系统
1 培养基制备-将1瓶Reveal 8小时培养基（或Reveal 8小时改良培养基）加入到**的无菌袋内，加入225ml 42℃的无菌水，抓牢袋子离顶部2-3英寸处并用力混匀，直到溶解，将袋子放到架子或其它支撑物上。在使用之前培养基可保持在42℃，但是不要超过6个小时。*好是制备好立即使用。
2 加样-取25g样品到无菌基内，抓紧袋子并使样品混匀，用一边到另一边的方式剧烈晃动袋子，确保彻底混匀；
参考办法：将袋子放到摇床内，用正常速度下混匀2分钟。
3 温育-松散地紧闭袋子42±1℃培养8小时。
不要密闭袋子，空气交换对大肠杆菌O157：H7适宜生长及抗原表达是必需的
4 混匀-8小时培养后，从温箱中取出袋子，抓牢袋子离顶部2-3英寸处，支撑底部，并用一边到另一边的方式剧烈混匀。
5 样品处理
（1） 使用无菌吸管，移取5ml样品到聚丙烯或玻璃试管内，加热：
·如果使用聚丙烯试管，放置于水浴中20分钟；使用玻璃试管，放置水浴中10分钟；
·或者将试管放置于微波炉中，沸腾即可。
（2） 沸水中取出试管，放置到室温（15-30℃），为了迅速冷却，可放置在冷的流水下，小心不要让水进入试管内。
即可对样品检测，步骤见下。
B 20小时检测系统
1培养基制备-将1瓶Reveal 20小时培养基（或Reveal 20小时专用培养基）加入到无菌袋内，加入225ml 36±1℃的无菌水，抓牢袋子离顶部2-3英寸处并用力混匀，直到溶解（大约1分钟），将袋子放到架子或其它支撑物上。在使用之前培养基可保持在36±1℃，但是不要超过6个小时。*好是制备好立即使用。以下富集培养基被FSIS使用于肉类及家禽样品中大肠杆菌O157：H7分离：
新生霉素改良EC肉汤（mEC+N）
蛋白胨 20.0 g/L
胆盐#3 1.12 g/L
乳糖 5.0 g/L
磷酸氢二钾（二元碱） 4.0 g/L
磷酸二氢钾（一元碱） 1.5 g/l
氯化钠 5.0 g/L
蒸溜水 1.0 L
如果有必要，在**前用1N HCl调整pH到6.9±0.1，121℃下**15分钟，冷却，每升培养基（20mg/L）中,加入5ml过滤**的4mg/ml活性新生霉素钠水溶液，互生培养基是附加了1.12g/L胆盐、1.5g K2HPO4以及20mg/L新生霉素的胰胨豆胨培养液。
2 加样-加入25g样品到含225ml mEC+N的无菌袋中，封紧袋子，放置**分离器中2分钟。
3温育-松散地紧闭袋子，36±1℃培养20小时。
不要密闭袋子，空气交换对大肠杆菌O157：H7适宜生长是必需的
4 混匀-20小时培养后，从温箱中取出袋子，抓牢袋子离顶部2-3英寸处，支撑底部，并用一边到另一边的方式剧烈混匀。
即可对样品检测，步骤见下。
二 、用Reveal检测
A 在使用之前，放置检测装置到室温下（25℃）
B 从锡箔袋中取出必要数量的大肠杆菌O157：H7检测装置，放置在平面上，对每个样品贴上标签
C 用塑料移液器取样品
警告：对煮沸过的8小时样品：
不要旋涡、搅拌或摇动样品
不要搅动样品底部的颗粒
只移取液体样品
D 使移液器垂直于检测装置样品区上面，无论使用8小时或20小时检测系统，加入5滴样品到检测装置样品区内
参考方法：使用移液器，加入120µl样品至样品区
E 检测装置显色15分钟后观察并记录检测结果。由于过度显色，20分钟后观察的结果是不准确的。
提示
如果加入适量的样品到检测装置后没有液体溢出，可以多加一滴或数滴，颗粒物会取代必要量的样品开始层析流检测。
四、结果的解释
外观表现 结果
15分钟内在C、T区都出现显色线 阳性
只有C区出现显色线，T区没有显色线 阴性
如果C区没有显色线，无论T区出现显色线与否 无效
五、确认
初步鉴定为阳性的样品应该用被认可的USDA/FSIS或**学分析指南（BAM）中的大肠杆菌O157：H7检测方法进行确认，“步骤二”培养袋中富集的样品可以用于确认试验。