根据本病的流行情况、临床症状及病理变化可做出初步诊断。但本病的确诊必须进行病原分离鉴定及血清学检查。
（1）病原分离鉴定 可直接采取病鸡气管、气囊渗出液或鼻甲骨、肺组织等，加液体培养基磨碎作成悬液，接种于适宜的含有液体培养液的支原体培养基琼脂斜面，在37℃至少培养5～7天。在初次分离时，其所有的培养基在每100毫升中须加1%醋酸铊溶液0.25毫升和青霉素10万单位，以抑制其他杂菌生长。初次分离常不见生长，须每隔3～5天从培养管内吸收培养液0.5～1.0毫升L，盲目传代移植至新管，连续2～3次以后，待加有酚红指示剂的液体培养基变黄即知有支原体生长。以此培养物做染色、培养菌落观察、血细胞凝集，鸡胚、雏鸡接种试验，还可将培养物制成抗原，与已知抗血清作血清学试验，以证明是否为鸡毒支原体。
（2）血清学检查 目前有凝集试验(包括全血凝集反应和快速平板上凝集反应)和血凝抑制试验两种。
快速平板法是取被检鸡血清或全血1滴置于白瓷板或玻璃板上，再加1滴已知的染色抗原充分混合，经1～2分钟内出现蓝紫色凝块的可判定为阳性。本方法是实验室内的一种简易快速的诊断方法，能很快测知血清中的抗体凝集价。
（3）鉴别诊断 本病应注意与鸡传染性****、鸡传染性喉气管炎及传染性鼻炎等呼吸道传染病的区别。鸡传染性****在鸡群中传播迅速；鸡传染性喉气管炎，气管黏膜呈出血性炎症，当病程延长后，气管黏膜表面常有一种凝固的干酪样物质；单纯的传染性鼻炎，病鸡面部发生水肿性肿胀和流泪，其病变一般不侵害气囊。
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